iPS细胞是什么?
iPS是指体细胞经过导入特定的重编程因子而诱导为多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPScells)。年,日本科学家Yamanaka及其研究小组首次选用逆转录病毒作为载体,向鼠成纤维细胞中导入了与多功能性有关的基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4),之后选择多能性标志物Fbx15筛选转染后的细胞,最终获得了具有与胚胎干细胞(ES)某些特性的多功能干细胞,并命名为诱导多能干细胞(iPS细胞),此细胞在形态、基因和蛋白表达、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。次年,该研究小组又成功将人体细胞重编程为iPS细胞,自此,在全球范围内拉开了iPS细胞研究的序幕。与ES细胞相比,iPS细胞的产生解决了几个重大问题。首先,伦理学专家认为干细胞的产生不应该破坏任何一个胚胎,而iPS细胞绕过了这个伦理学问题;其次,iPS细胞可以由患者个体的成体细胞重编程得来,为个体化的疾病细胞模型提供了有力的基础;最后,由iPS细胞诱导分化而来的成体细胞,可以应用于患者疾病的临床治疗,为再生医学提供一个崭新的思路。iPS细胞如何诱导?
科学家最早用逆转录病毒,将多能基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4导入细胞获得iPS细胞,此方法有外源基因插入的风险,后续有科学家用腺病毒,质粒转染法,合成RNAs和蛋白质等无外源基因整合风险的方法将多能基因导入细胞获得iPS细胞。iPS重编程过程中,多能基因的选择至关重要,目前已知的候选基因有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin-28等,但是在研究中有研究者发现,除了Oct4外其他的基因都可被其他转录因子所代替,因此这也间接证明了Oct4是诱导形成iPS细胞的必需基因。利用多能基因方法效率都极低,相对而言,最高的是有外源基因插入风险的逆转录病毒载体法。因此,科学家们不断探索更安全更高诱导效率的方法。有研究者发现,在诱导过程中加入丙戊酸VPA,维生素C,SV40大T抗原,强力霉素等小分子能提高诱导效率。目前在实验室应用最多的是质粒和仙台病毒,在再生医学方面应用最多的是附加型质粒,在体外研究应用最多的是逆转录病毒和质粒。
iPS细胞如何进行基因敲除?
诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞,具备多向分化潜能和自我更新能力,而且IPS细胞也保留了细胞来源个体的遗传背景。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建基因敲除、点突变和敲入IPS细胞,可为多种疾病的发生和治疗提供有效的研究模型。
iPS细胞基因敲除实验流程
iPS细胞基因编辑有哪些应用范围?
·CISH-/-iPSC-NK细胞提高抗肿瘤活性
研究人员将供体的皮肤或血细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC),然后再定向分化为NK细胞(iPSC-NK细胞),在iPSC-NK细胞中利用CRISPR/Cas9技术将CISH基因敲除,该基因调控含SH2蛋白的表达(CIS;CISH的蛋白产物),CIS是信号传导的关键负调控因子。研究结果表明,CISH-/-iPSC-NK细胞在白血病异种移植模型中,敲除后的NK细胞增强了对肿瘤生长的抑制,而且敲除后的NK细胞在体内的持久性也显著增加了。CISH的缺失增强了NK细胞的功能,CIS通过调节人类NK细胞代谢活性从而在抗肿瘤活性方面起着关键作用。
图1.从人类iPSC中构建CISH-/-iPSC-NK细胞
·iPSC技术用于ASD发病机制研究自闭症谱系障碍(ASD)是一种复杂性的神经发育障碍性疾病,在表型和遗传上具有异质性。研究人员通过插入蛋白质标签和提前终止密码子,为iPSC细胞系中10个功能不同的ASD风险基因设计了完全敲除的基因编辑策略(AFF2/FMR2,ANOS1,ASTN2,ATRX,CACNA1C,CHD8,DLGAP2,KCNQ2,SCN2A,TENM1),且所有突变都在相同的“等基因”(遗传背景相同)中产生,以此研究ASD风险基因的基因功能。将KOiPSC细胞诱导分化为兴奋性神经元,采用RNA测序对诱导分化神经元的转录特性进行研究,揭示了几个神经元网络的融合。同时使用膜片钳和多电极阵列方法,发现不同突变的电生理缺陷是不同的,但它们最终会导致突触活动持续减少。尽管ASD易感基因属于不同的基因本体,但等基因的干细胞可以揭示常见的功能表型,例如神经元连接功能降低。鉴于ASD的异质性,这类基于CRISPR等基因的敲除系统可能对逐步控制的细胞表型实验是必不可少的。图2.iPSC细胞的KO与相关基因检测·在iPSC衍生的人类类器官疾病模型中研究miRs失调的病理途径microRNA(miRs)是一类非编码小RNA,它们在发育和生理背景下具有重要的调节作用。Kung等在人类iPSC细胞中敲除了miR-26b茎环基因,以探索miR-26b在发育和疾病中的作用。该基因编辑的细胞系表现出正常的核型,表达多能性标记并分化为三个胚层的细胞。这为研究发育提供了一个良好的实验模型,并阐明了iPSC衍生的人类类器官疾病模型中miR-26b下游调节异常的病理途径。图3.iPSC细胞中miR-26b的敲除与鉴定·F9基因敲入的iPSC细胞用于血友病治疗目前对血友病的标准治疗方案是细胞替代疗法,虽然有效,但存在一定的病毒感染的风险,而且需要终身治疗,只有基因疗法才有可能从根本上治愈血友病。从患者的外周血单核细胞(PBMC)中诱导,形成iPSC细胞,构建了靶向AAVS1靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-EF1α-F9cDNA-嘌呤霉素donor,并将它们通过电转导入iPSC中,成功地将人全长F9cDNA敲入iPSCs的AAVS1位点。然后将iPSC分化为肝细胞,发现该肝细胞可以稳定分泌人凝血因子IX(hFIX),并能够在短期内移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠中,这为血友病的临床基因治疗提供了一种新方法。图4.F9cDNA插入HBiPSCsAAVS1位点·iPSC细胞的双敲除技术揭示细胞凋亡机制
已有研究表明,BAX和BAK在小鼠胚胎生长过程中都是必不可少的,并且在人类癌细胞系中证实了BAX和BAK在细胞凋亡过程中线粒体裂变中的作用。但是由于缺乏合适的研究模型,BAX和BAK在人类大脑发育中的功能仍然难以捉摸。Joshi等在人诱导多能干细胞(hiPSCs)、hiPSC衍生的神经祖细胞(hNPCs)、神经玫瑰花结和大脑类器官中双敲除BAX/BAK基因,用来揭示BAX和BAK缺失在体外模型中的对人类大脑早期发育的影响。发现BAX和BAK缺陷细胞具有异常的线粒体形态并导致皮质结构异常。由此认为BAX和BAK在人类发育过程中的关键功能,包括维持线粒体形态的稳态,这对于皮质祖细胞和神经元的正常发育至关重要。
图5.BAX/BAKDKOhiPSCs细胞死亡表型的表征和验证
看完以上的案例解析,大家对IPSC实验设计是否已经有了灵感,跃跃欲试了呢?然而IPSC基因编辑细胞的构建是个耗时的过程,特别是单克隆细胞的筛选,费事费力;而且想要最终拿到基因编辑效果彻底的IPS细胞并不容易,例如在构建的过程中,细胞培养条件的稍不注意便可能导致IPS细胞的分化。
作者:海星生物