雷帕霉素靶蛋白（TOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在酵母、植物和哺乳动物中进化保守。在植物中，TOR激酶作为一个信号枢纽，整合各种营养、能量、激素和环境信号。葡萄糖（Glc）-TOR信号枢纽能够协调参与到植物生命的每个阶段，从胚胎发生、分生组织激活、根和叶的生长、开花、衰老等。近年来的研究也揭示了其在植物环境胁迫反应中的多方面作用。这些研究更多地集中于TOR激酶如何调控蛋白质翻译，而对于TOR激酶在转录组水平的调控作用却较少涉及。
年3月4日，福建农林大学熊延课题组在国际顶级学术期刊Nature上发表题为“TheTOR–EIN2axismediatesnuclearsignallingtomodulateplantgrowth”的研究论文。该论文揭示了乙烯（Eth）信号通路核心因子EIN2蛋白作为TOR激酶的直接底物，通过其核质穿梭的特性介导了由Glc-TOR信号通路引起的全局快速转录组重编程。通过多种实验论证，该研究揭示了Glc-TOR信号通路和Eth-CTR1信号通路通过影响EIN2蛋白中不同的磷酸化位点赋予了EIN2蛋白独特功能的分子机制。
研究背景
1.雷帕霉素（rapamycin）是一种由链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)产生的抗生素。在酵母中，雷帕霉素处理导致细胞分裂停止并模拟氮（N）饥饿的表型。研究人员首先通过遗传筛选方法在多种真核生物中鉴定到雷帕霉素靶蛋白（targeofrapamycin，TOR），并发现雷帕霉素通过FKBP2蛋白和TOR形成复合体来抑制TOR的激酶活性。在年的JBC文章中熊延老师就发现，拟南芥中FKBP12蛋白表达量较低导致拟南芥仅对于较高浓度的雷帕霉素才有明显的响应，并且通过基于拟南芥S6激酶（S6K）的保守磷酸化位点T建立了监测内源性TOR激酶活性的检测方法。
2.在拟南芥中TOR激酶缺失突变体会导致胚胎致死，给研究工作带了极大的阻碍。因此科学家们通过使用多种TOR激酶抑制剂（如rapamycin，Torin2或者AZD），以及构建雌二醇诱导型抑制TOR基因表达的转基因材料tor-es，来瞬时条件性地抑制TOR活性。早期研究发现，在黑暗条件下，外源施加Glc促进黄化苗下胚轴伸长，然而抑制TOR激酶活性会导致Glc诱导的黄化苗下胚轴伸长被抑制，呈现类似乙烯反应的表型。
3.乙烯是一种重要的植物气体激素，乙烯信号通路对植物生长发育以及适应各种生物或非生物胁迫都发挥着重要的作用。在过去的30年内，通过使用“三重反应”进行突变体表型分析和筛选，科学家们鉴定到了多个乙烯信号转导通路的重要成员。在模式植物拟南芥中，乙烯首先被5个ER膜上的乙烯受体感知，从而抑制下游Raf-like激酶CTR1对乙烯通路的核心信号组分EIN2的磷酸化修饰。不被磷酸化修饰的EIN2蛋白进一步被切割并且其C末端被转运入核执行功能。下游的核心转录因子EIN3/EIL1因此被稳定，调控绝大部分乙烯响应基因的表达。在拟南芥以及水稻中功能缺失的EIN2突变体对乙烯不敏感。Eth-CTR1-EIN2信号介导的磷酸化位点主要有两个，一个是Ser位点（由JoeEcker课题组报道），另一个是Ser位点（由CarenChang课题组报道），磷酸化修饰的EIN2蛋白会被稳定在ER膜上，从而使得下游的相关信号通路不能被激活。
主要研究结果
1.乙烯信号通路的核心因子EIN2，EIN3/EIL1参与到Glc-TOR介导的信号转导
作者首先通过筛选突变体，发现乙烯信号通路核心因子EIN2，EIN3/EIL1的突变体黄化苗下胚轴的伸长显著拮抗多种TOR激酶抑制剂的抑制作用，而乙烯受体ETR1的突变体或者乙烯合成被阻断并不能缓解这种抑制作用。进一步通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验，研究人员发现EIN2蛋白的C末端结构域（EIN2-C）与TOR激酶存在体内互作，而与上游的CTR1激酶或者下游的EIN3/EIL1转录因子均没有互作。同时，TOR激酶抑制剂会破坏EIN2-C与TOR激酶的互作，表明EIN2-C很可能是TOR激酶作用的直接底物。进一步研究发现，去除外源添加的Glc或者抑制TOR激酶活性通过以依赖于EIN2的方式稳定EIN3蛋白和诱导ERF1基因的表达。这些结果表明，EIN2可以独立于乙烯传感和信号通路，作为TOR的直接底物，调节EIN3蛋白的稳定性和ERF基因的表达，从而抑制下胚轴伸长。
图1.Glc-TOR信号通路调控下胚轴伸长依赖于EIN2、EIN3和EIL1
2.Glc-TOR信号通路与经典的Eth-CTR1信号通路通过不同的EIN2磷酸化位点来调控信号转导
随后借助质谱手段，研究人员在体内以及体外实验中均鉴定到了TOR激酶特异性磷酸化EIN2蛋白的位点为Thr，这与乙烯信号通路中CTR1对EIN2蛋白的磷酸化位点不同（Ser，Ser）。之前的研究发现，在乙烯信号通路中，磷酸化的EIN2蛋白会被稳定在ER膜上，而乙烯处理会导致EIN2蛋白快速去磷酸化从而被切割入核。通过观察p35S::EIN2-GFP/ein2-5和p35S::GFP-EIN2/ein2-5两种转基因材料发现，TOR激酶抑制剂处理会使得这两个转基因材料中的EIN2蛋白核定位信号显著增强，而乙烯处理仅仅使得EIN2-GFP蛋白的核定位信号显著增强。随后通过在原生质体中进行荧光共定位实验和核分离实验均表明TOR激酶抑制剂处理会导致EIN2蛋白全长穿梭入核，而不是EIN2-C末端切割入核。进一步通过构建在EIN2蛋白不同位点模拟磷酸化和组成性去磷酸化的转基因材料，作者发现Glc-TOR信号通路与经典的Eth-CTR1信号通路通过各自独特的EIN2磷酸化位点来调控EIN2的细胞核转运从而介导了下胚轴的伸长。
图2.TOR激酶特异性磷酸化EIN2蛋白的Thr位点从而独立于Eth-CTR1-EIN2信号模块调控下胚轴伸长
3.EIN2蛋白在Glc-TOR信号枢纽介导的转录组重编程和激活根尖分生组织中扮演重要作用
进一步通过mRNA测序分析，作者发现Glc-TOR信号枢纽引起的转录组重编程很大程度依赖于EIN2蛋白（76%的上调转录本和66%的下调转录本在ein2-5背景中都减少了）。这些通路包括细胞周期与DNA复制、细胞壁合成与脂质合成等以及多种次生代谢途径，比如硫酸盐同化，硫代葡萄糖苷和黄酮醇的合成等，这些对于根尖分生区的细胞快速分裂都十分重要。在葡萄糖饥饿条件下，野生型的幼苗由于根尖分生区细胞分裂活力消退从而表现出短根的表型。与之相反，在ein2-5突变体中根尖分生区活力旺盛，表现出长根的表型，但是在ein3eil1，etr1-1突变体中并没有表现出ein2-5类似的表型，暗示Glc-TOR-EIN2调控的根尖细胞增殖活力独立于乙烯的感知和信号转导。遗传分析表明，EIN2蛋白中Thr和Ser的磷酸化状态在根分生组织中能够解偶联Glc-TOR和乙烯调控的细胞增殖。进一步研究发现，参与Glc-TOR信号枢纽激活根尖分生区分裂活性的重要转录因子E2Fa在ein2-5背景中被显著上调，因此Glc-TOR和乙烯信号通过EIN2中不同磷酸化状态（磷酸化密码）控制下游不同的转录因子来实现差异化调控各自特异转录组变化。
图3.由Glu-TOR-EIN2信号通路控制的细胞增殖独立于经典乙烯信号通路
一图解文
图4.Glu-TOR-EIN2信号转导枢纽介导核信号调控植物生长
Glu-TOR-EIN2信号枢纽调控植物生长发育的模型。葡萄糖信号激活的TOR激酶可以直接磷酸化EIN2蛋白以抑制其穿梭入核。在无糖条件下，去磷酸化的EIN2蛋白进入细胞核，并通过不同的下游效应子控制根分生组织的激活（E2Fa等转录因子）和下胚轴细胞的伸长（EIN3/EIL1-ERF1等转录因子）。
意义与展望
本研究揭示了植物可以利用不同磷酸化形式的EIN2蛋白作为“磷酸化密码”，精确地区分Glc-TOR和乙烯信号传导从而控制细胞增殖和生长的分子机制。总的来说，该研究更加全面地揭示了Glc-TOR信号模块复杂、多方面的功能，以及其在与植物激素调控网络上扮演多样化的角色。值得注意的是该研究发现TOR激酶活性被抑制的情况下，全长的EIN2蛋白可以进入细胞核，这不同于经典Eth-CTR1信号通路介导的EIN2-C末端穿梭入核机制，暗示了不同形式的EIN2蛋白入核可能执行不同的功能，这些未知之处也将是未来探索的重要方向。
作者与课题组介绍
福建农林大学海峡联合研究院基础林学蛋白质中心的熊延教授为该论文的通讯作者。中国科学院上海植物逆境中心为本论文第一单位。福建农林大学的付力文博士与刘岩林博士为共同第一作者。中科院上海植物逆境研究中心的秦国臣博士、訾海玲博士、徐钟天博士，国家蛋白质中心（上海）质谱设施的彭超研究员和吴萍，福建农林大学海峡联合研究院基础林学蛋白质中心的左泽乘教授及其课题组成员李亚星，北京大学药学院黄超兰教授教授，福建农林大学农林大数据中心刘仁义教授，韩国高丽大学Sang-DongYoo教授和Young-HeeCho教授以及熊延教授课题组成员赵晓迪、王玥、杨书慧为论文的共同作者。熊延教授的主要研究领域是植物营养信号转导机制研究。近年来在Nature、MolecularCell、PNAS等高水平杂志上发表多篇研究论文。
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